對于治療嚴(yán)重的心臟瓣膜疾病，人工瓣膜在大多數(shù)成年人中效果相當(dāng)好；然而，對于兒科患者，還有一個(gè)額外的要求，即更換瓣膜要隨著孩子一起成長，因此極大地限制了目前的治療選擇。組織工程心臟瓣膜 (TEHV)，例如源自自體骨髓干細(xì)胞 (BMSC) 的瓣膜，有可能重現(xiàn)天然瓣膜結(jié)構(gòu)并適應(yīng)軀體生長。然而，促進(jìn)與天然組織的定向整合而不是隨機(jī)、不受控制的生長的基本前提是了解 BMSC 對瓣膜相關(guān)機(jī)械環(huán)境的機(jī)械生物學(xué)反應(yīng)。在這里，我們報(bào)告了人類 BMSC 接種聚合物結(jié)構(gòu)對瓣膜相關(guān)應(yīng)力狀態(tài)的反應(yīng)：(i) 單獨(dú)穩(wěn)定流動(dòng)，(ii) 單獨(dú)周期性彎曲，以及 (iii) 周期性彎曲和穩(wěn)定流動(dòng) (彎曲流動(dòng)) 的組合。將 BMSC 接種到 PGA：PLLA 聚合物支架上并在靜態(tài)培養(yǎng)中培養(yǎng) 8 天。隨后，再施加上述機(jī)械條件（組別包括穩(wěn)定流（850ml/min）、周期性彎曲（1 Hz）和彎曲流（850ml/min 和 1 Hz）。我們發(fā)現(xiàn)彎曲流組的樣本呈現(xiàn)瓣膜樣細(xì)胞分布，這些細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞（偏向表面）和肌成纖維細(xì)胞（偏向中間區(qū)域）表型。我們認(rèn)為這可能是由于存在明顯的流體誘導(dǎo)剪切應(yīng)力大小和振蕩剪切應(yīng)力，這些剪切應(yīng)力同時(shí)施加在樣本上。這些結(jié)果表明，彎曲流機(jī)械環(huán)境支持 BMSCs 體外定向分化為心臟瓣膜表型，這可通過細(xì)胞分布和特定基因標(biāo)記的表達(dá)來證明。在柔性流動(dòng)條件下，BMSC 衍生的工程組織生長的先驗(yàn)指導(dǎo)可能有助于隨后促進(jìn)體內(nèi)受控的、工程化的天然組織整合過程，而這對于成功實(shí)現(xiàn)長期瓣膜重塑必不可少。

一、簡介

心臟瓣膜在控制單向血流方面起著重要作用。然而，出生缺陷或感染（例如風(fēng)濕熱）可能導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)心臟瓣膜功能障礙，這可能導(dǎo)致兒童出現(xiàn)嚴(yán)重的瓣膜異常。植入物設(shè)計(jì)和手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步大大提高了成人患者人工心臟瓣膜的成功率。然而，由于這些植入物無法促進(jìn)軀體生長和瓣膜組織重塑，因此其在兒科患者中的療效受到嚴(yán)重限制；因此，多次大手術(shù)和再次手術(shù)很常見，這給成長中的孩子帶來了巨大的健康負(fù)擔(dān)。

與天然瓣膜類似，組織工程心臟瓣膜 (TEHV) 具有適應(yīng)和隨宿主進(jìn)化的能力，在概念上被認(rèn)為是治療心臟瓣膜疾病的永久解決方案。在每個(gè)心動(dòng)周期中，天然瓣膜都會因血流而不斷受到機(jī)械應(yīng)力；例如，主動(dòng)脈瓣葉在收縮中期會經(jīng)歷由液體引起的峰值剪應(yīng)力，約為 5-6 達(dá)因/厘米2。機(jī)械刺激應(yīng)用于發(fā)育中的心血管組織時(shí)，會改變基因表達(dá)，促進(jìn)組織重塑事件，進(jìn)而增強(qiáng)特定的機(jī)械和表型特征。天然心臟瓣膜會受到高度復(fù)雜的周期性、拉伸和液體引起的應(yīng)力。在工程心臟瓣膜組織中，機(jī)械刺激，尤其是結(jié)合液體引起的剪應(yīng)力的刺激，可增強(qiáng)祖細(xì)胞分化途徑并構(gòu)建用于瓣膜應(yīng)用的組織特性。例如，研究人員使用脈動(dòng)流生物反應(yīng)器裝置進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該裝置增強(qiáng)了 TEHV 三葉結(jié)構(gòu)，與靜態(tài)培養(yǎng)的對應(yīng)物相比，膠原蛋白細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 含量增加了約 300%。在其他地方，已經(jīng)建造了生物反應(yīng)器來耦合任何組合的流動(dòng)、循環(huán)拉伸和循環(huán)彎曲 (FSF 生物反應(yīng)器)，這也證實(shí)了耦合的機(jī)械刺激顯著促進(jìn) ECM 的產(chǎn)生；特別是，與心臟瓣膜相關(guān)的穩(wěn)定流與循環(huán)彎曲的組合，研究人員表明，血流誘導(dǎo)的振蕩剪切應(yīng)力 (OSS) 直接調(diào)節(jié)斑馬魚模型中來自 kruppel 樣因子基因家族 KLF2A 的轉(zhuǎn)錄因子的正常表達(dá)。KLF2A 基因與瓣膜形成密切相關(guān)，其缺失會導(dǎo)致心臟瓣膜缺陷。

由于缺乏有關(guān)優(yōu)化體外培養(yǎng)過程所需的機(jī)械生物學(xué)事件的信息，功能性 TEHV 的生成仍然難以捉摸。盡管如此，在機(jī)械指導(dǎo)下，組織工程可行性研究迄今已證明，天然瓣膜細(xì)胞可以重現(xiàn)具有足夠機(jī)械強(qiáng)度和形態(tài)的瓣膜結(jié)構(gòu)。此外，非瓣膜細(xì)胞，如骨髓干細(xì)胞 (BMSC)、隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (EC)、升主動(dòng)脈肌成纖維細(xì)胞和臍帶衍生細(xì)胞，在機(jī)械調(diào)節(jié)狀態(tài)下表現(xiàn)出瓣膜 ECM、DNA 含量和體外內(nèi)皮化的增加。

BMSC 尤其在心臟瓣膜組織工程方面顯示出巨大的前景，因?yàn)樗鼈兪嵌嗄芨杉?xì)胞，免疫原性風(fēng)險(xiǎn)極小，沒有道德/法律問題，并且可以輕松獲取和培養(yǎng)擴(kuò)增；通常，BMSC 可以在幾天內(nèi)分離、純化并大量擴(kuò)增。BMSC 在體外保持廣泛的分化、增殖和克隆形成能力。人類 BMSC 對機(jī)械調(diào)節(jié)有反應(yīng)，并且已被證明可以在體外產(chǎn)生心臟瓣膜 ECM 成分。研究人員描述了闡明組合循環(huán)彎曲和穩(wěn)定流動(dòng)狀態(tài) (flex-flow) 的影響的開創(chuàng)性工作，這有助于顯著促進(jìn)源自 BMSC 的從頭工程心臟瓣膜組織中的工程膠原蛋白。然而，在組織規(guī)模上評估 TEHV 研究的一個(gè)基本前提是需要了解瓣膜相關(guān)機(jī)械刺激可以調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)的過程，特別是在干細(xì)胞來源的背景下的細(xì)胞分化。因此，在這項(xiàng)研究中，我們的主要目標(biāo)是確定 BMSC 對 flex-flow 條件在促進(jìn)瓣膜形成方面的獨(dú)特反應(yīng)。

二、材料與方法

2.1 BMSCs 培養(yǎng)與擴(kuò)增

從人骨髓中分離的 BMSCs，用基質(zhì)、干細(xì)胞和造血標(biāo)志物進(jìn)行表征和測試，購買于冷凍小瓶中。從干冰包裝中回收細(xì)胞，立即解凍并用預(yù)熱的培養(yǎng)基稀釋，以減少到達(dá)時(shí)冷凍保存試劑的毒性作用。將約 5 x 10^5 個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 T75 通風(fēng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并置于 37℃、濕度為 95%、CO2 為 5% 的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)瓶在 1 周時(shí)完全匯合。每次傳代平均獲得 2 x 10^6 個(gè)細(xì)胞。使用新鮮配制的干細(xì)胞培養(yǎng)基（含 10% 高級干細(xì)胞未分化生長補(bǔ)充劑、1% 青霉素和鏈霉素培養(yǎng)基）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，我們一直保持無菌細(xì)胞和組織培養(yǎng)環(huán)境。第 6 至 8 代的 BMSC 用于后續(xù)的組織工程實(shí)驗(yàn)。

2.2 支架制備和細(xì)胞接種

支架材料為等比例的聚乙醇酸 (PGA) 和聚 L-乳酸 (PLLA) 無紡布聚合物氈 。切割長 17 毫米、寬 6 毫米、厚 1 毫米的樣本 (n = 12)，并將兩個(gè)金屬彈簧小心地連接到支架的兩端。在我們定制的 U 形生物反應(yīng)器裝置中進(jìn)行動(dòng)態(tài)組織培養(yǎng)需要此組件 (圖 1)；更多圖紙和細(xì)節(jié)可參見研究人員的文章。在細(xì)胞接種之前，用環(huán)氧乙烷 (EtO; AN 306, Anprolene, Andersen Products Inc, HawRiver, NC) 對支架進(jìn)行氣體滅菌 12 小時(shí)，并用 70% 乙醇處理。按照制造商的說明指南中所述的建議進(jìn)行曝氣程序。使用以下方案完成接種程序：用杜氏磷酸鹽緩沖鹽水 (DPBS, Fisher Scientific) 緩沖液沖洗約 90% 的匯合燒瓶。接下來，加入 0.25% 胰蛋白酶和乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液，在 37℃ 下孵育 3 分鐘。用等體積的血清中和胰蛋白酶溶液。將細(xì)胞懸浮液收集在 15 毫升錐形管中，以 1700 rpm 的速度離心 5 分鐘。通過去除上清液回收細(xì)胞沉淀，并用新鮮制備的組織培養(yǎng)基懸浮以供進(jìn)一步使用。單個(gè)支架上接種了 2 x 10^6 BMSC，并懸浮在 50 毫升通風(fēng)錐形管中的 20 毫升組織培養(yǎng)基中。組織培養(yǎng)基由杜爾貝科改良的 Eagle 培養(yǎng)基 (DMEM，F(xiàn)isher Scientific) 組成，其中補(bǔ)充了 10% 胎牛血清、1% 青霉素和鏈霉素、2ng/ml 堿性成纖維細(xì)胞生長因子和 82 μg/ml 抗壞血酸 2 磷酸鹽 (AA2P，Sigma-Aldrich)。隨后，將這些管放入細(xì)胞和組織培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)式烤盤中，轉(zhuǎn)速為 8 RPM。每兩天更換一次培養(yǎng)基，并將 BMSC 接種的支架在旋轉(zhuǎn)式烤盤培養(yǎng)下培養(yǎng)，總共 8 天。

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圖 1. a) 定制 U 形生物反應(yīng)器的示意圖，該生物反應(yīng)器連接到線性致動(dòng)器，該致動(dòng)器引導(dǎo)穿過樣品的桿，使它們彎曲和伸直。b) 插圖：顯示調(diào)節(jié)室內(nèi)的三個(gè)樣品，一端（環(huán)）可以移動(dòng)，另一端（銷）固定。在當(dāng)前研究中，致動(dòng)器設(shè)置為 1 Hz 頻率以允許周期性彎曲，同時(shí)泵以 850 ml/min 的穩(wěn)定流速運(yùn)行。

2.3 組織工程實(shí)驗(yàn)

在前 8 天的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)后，將樣本隨機(jī)分配到四個(gè)不同的處理組之一，并進(jìn)行額外的 14 天組織培養(yǎng)。這些組為（n = 12 個(gè)樣本/組）：1) 無流動(dòng)（靜態(tài)控制），2) 單獨(dú)穩(wěn)定流動(dòng)（流動(dòng)），3) 單獨(dú)樣本循環(huán)彎曲（彎曲）和 4) 穩(wěn)定流動(dòng)和樣本循環(huán)彎曲的組合（彎曲流動(dòng)）。對于機(jī)械調(diào)節(jié)組，使用之前詳細(xì)描述過的定制 U 形生物反應(yīng)器。該裝置連接到蠕動(dòng)泵和環(huán)境密封的線性執(zhí)行器以用于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。?shí)驗(yàn)裝置由四個(gè)相同的調(diào)節(jié)室組成，每個(gè)室包含 3 個(gè)樣本。標(biāo)本的一端用銷釘固定，另一端連接到圓形移動(dòng)柱上。對于 Flex 和 Flex-Flow 實(shí)驗(yàn)，移動(dòng)柱沿軸向線性移動(dòng)，使用線性致動(dòng)器（頻率為 1 Hz）啟動(dòng)樣品循環(huán)彎曲。對于 Flow 和 Flex-Flow 案例，使用蠕動(dòng)泵來維持 850 ml/min 的連續(xù)流速（S1 文件）。

2.4 膠原蛋白含量

所有四組的樣本在 22 天后取出（每組 n = 3）并進(jìn)行膠原蛋白生化測定。消化的膠原蛋白樣品的定量方法與之前描述的方法類似。用 0.5 M 乙酸溶液（Sigma）和胃蛋白酶（1 mg/ml 胃蛋白酶（P7000），Sigma）消化樣品。在搖床上在 4℃ 下進(jìn)行 16 小時(shí)的消化。然后根據(jù) Sircol 可溶性膠原蛋白測定試劑盒（Biocolor Ltd.）提供的體外組織程序?qū)δz原蛋白提取物進(jìn)行測定。將多模式微孔板讀數(shù)儀設(shè)置為 555 nm 的吸光度以獲得膠原蛋白濃度。

2.5 組織學(xué)

為了檢測關(guān)鍵瓣膜 ECM 成分（膠原蛋白、糖胺聚糖 (GAG) 和彈性蛋白）的存在，對培養(yǎng)的工程組織和新鮮收獲的豬天然主動(dòng)脈瓣葉（作為陽性對照）進(jìn)行了組織學(xué)處理。在室溫下，用 DPBS 清洗樣品，并用 10% 福爾馬林固定過夜，體積分?jǐn)?shù)為 20:1。固定后，用剪刀剪下 2 毫米 x 2 毫米的組織切片，并嵌入組織冷凍培養(yǎng)基中。為了保留結(jié)構(gòu)，將組織在室溫下用液體冷凍培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿中孵育 2 小時(shí)。接下來，還將液體冷凍培養(yǎng)基單獨(dú)添加到塑料模具中，并在液氮溫度下冷凍。約 1 分鐘后，獲得白色固體冷凍介質(zhì)床。此時(shí)，將準(zhǔn)備好的組織切片小心地放在模具內(nèi)的冷凍固體床上，并添加更多冷凍介質(zhì)以浸泡樣品。隨后將模具在液氮中速凍。最后，使用低溫恒溫切片切割與組織表面平行的連續(xù)切片（厚度為 12 μm）。將切片安裝到玻璃載玻片上。使用制造商提供的染料將組織學(xué)染色劑應(yīng)用于組織切片，以便隨后進(jìn)行顯微鏡可視化。

2.6 免疫熒光染色

22 天后對 CD31 和 α-SMA 細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行免疫熒光染色（n = 3 個(gè)樣本/組），以分別檢測內(nèi)皮和肌成纖維細(xì)胞表型。本研究重點(diǎn)關(guān)注兩種瓣膜相關(guān)蛋白，例如分化簇 31 (CD 31) 和 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 (α-SMA)。已知 CD31 表達(dá)于 EC 表面和 SMC 中的 α-SMA，以及瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中的肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。每個(gè)樣本沿組織切片，用抗 αSMA 和抗 CD31 對三個(gè)不同層（即頂部表面層、深層中核層和底部表面層）進(jìn)行免疫染色，并評估 SMC 和 EC 表達(dá)情況。解剖從心臟分離的豬主動(dòng)脈瓣膜并將其指定為陽性對照。按照相同的方案對瓣膜小葉進(jìn)行免疫染色以檢測 EC 和 SMC 表達(dá)。

樣品固定、包埋和切片程序與前面描述的組織學(xué)方案相同（“材料和方法”中的“組織學(xué)”子部分）。接下來，對于免疫熒光檢測，遵循以下染色程序：將安裝在玻璃載玻片上的組織切片用 0.1% Triton X-100 處理 3 至 5 分鐘以增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)的通透性（CD31 染色不包括此步驟）。用 DPBS 進(jìn)行額外的洗滌步驟三次，每次 5-10 分鐘。通過在 DPBS 中加入 1% 山羊血清 30 分鐘來促進(jìn)非特異性表位的阻斷。所用的一抗為小鼠單克隆抗 CD31 和小鼠單克隆抗 α SMA。在 4℃ 下孵育過夜。用洗滌緩沖液 (DPBS+ 0.01% Triton-X 100) 洗滌樣品以降低背景。加入二抗 (山羊多克隆抗小鼠 IgG (H+L) (DyLight 488) (Fisher Scientific) 含 1% 山羊血清)，并在 4℃ 下孵育過夜，以進(jìn)行 CD31 和 α-SMA 免疫熒光染色。在熒光顯微鏡下觀察帶有染色切片的玻璃載玻片。對于 CD31，距離表面頂部 92±10.58 μm 的深度被視為頂層，距離底部表面 76±4 μm 的深度被視為底層，距離頂部表面 264±18.33 μm–652±17.43 μm 的深度被視為深層中芯層。同樣，對于 α-SMA，距離頂部表面 ~140±17.43 μm 的深度被視為頂層，距離底部表面 ~108±12 μm 的深度被視為底層，距離頂部表面 336±13.85 μm–464±21.16 μm 的深度被視為深層中芯層。

2.6.1 圖像分析

使用以下協(xié)議 (ImageJ, NIH; Bethesda, MD) 量化 CD31 和 α-SMA 染色圖像 (樣本大小, n = 3) 的信號強(qiáng)度值。定義一個(gè)面積為 10,000 像素的矩形感興趣區(qū)域 (ROI)。選擇并測量三個(gè)具有最大強(qiáng)度的不同 ROI (重復(fù), r = 3)。ROI 的平均強(qiáng)度以任意單位 (AU) 記錄。注意避免任何假陽性信號。

2.7 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (QRT-PCR)

組織培養(yǎng) 22 天后，對四組新生組織進(jìn)行基因表達(dá)評估，并對有限數(shù)量的瓣膜相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行量化，以驗(yàn)證免疫染色結(jié)果。如前所述，進(jìn)行定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (QRT-PCR)。用 DPBS 清洗工程組織，并根據(jù)制造商的方案 (SV Total RNA Isolation System,Promega) 分離總 RNA，從小組織樣本 (≤30mg) 制備裂解物。簡而言之，將 1ml 裂解緩沖液加入 30 mg 組織中，然后快速冷凍并用均質(zhì)機(jī)高速均質(zhì)，直至混合物中沒有可見的組織碎片。將 175 μl 組織裂解物轉(zhuǎn)移到 1.5 ml 微量離心管中。將沉淀物轉(zhuǎn)移至 1.5ml 無 RNase 微量離心管中進(jìn)行 RNA 分離。用 SV 總 RNA 分離系統(tǒng) (Promega) 純化總 RNA。利用分光光度計(jì) (Varian Carry 300) 驗(yàn)證分離的 mRNA 濃度和質(zhì)量。所有樣品測量均準(zhǔn)備了 60 倍稀釋液。RNA 純化數(shù)據(jù)在補(bǔ)充數(shù)據(jù)表 (S3 文件) 中提供。1 μg 總 RNA 用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并使用 GoScript 逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng) (Promega) 提供的寡核苷酸 (dT) 15 引物合成 cDNA。使用 GoTaq_qPCR Master Mix (Promega) 進(jìn)行 QRT-PCR。用 Step-One 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng) (Applied Biosystems) 檢測信號強(qiáng)度。PCR 混合物包含正向和反向引物以及 SYBR 綠 I 染料試劑，以及從逆轉(zhuǎn)錄中獲得的 cDNA。引物和基因均選自參考來源，所有引物均購買（Sigma Aldrich）。引物序列（表 1）GAPDH、YARS、KLF2A 序列使用 BLAST 程序獲得，國家生物技術(shù)信息中心 (NCBI)，F(xiàn)ZD2 和 MLC1F 來自研究人員。簡而言之，實(shí)驗(yàn)所用的條件如下：PCR 管在 95℃ 下保持 2 分鐘，然后開始循環(huán)以激活 Taq 聚合酶。循環(huán)參數(shù)為 95℃ 持續(xù) 5 秒；60℃ 持續(xù) 45 秒；95℃ 持續(xù) 15 秒。使用試劑指南中描述的 ΔΔCt 方法，對閾值循環(huán) (ΔCt) 值的變化取平均值，并用內(nèi)源基因 GAPDH 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?；虮稊?shù)變化的表達(dá)計(jì)算為 2- ΔΔCt，并比較四組（Static、Flow、Flex 和 Flex-Flow、PHV）的基因表達(dá)率以進(jìn)行進(jìn)一步分析。在每個(gè)完整的 QRT-PCR 循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析，以檢查任何污染、引物質(zhì)量或重復(fù)擴(kuò)增。GAPDH、YARS、FZD2、MLC1F、KLF2A 的熔解溫度 (Tm) 分別記錄為 (82.6±0.001)℃、(80.05±0.007)℃、(81.97±0.08)℃、(79.91±0.09)℃ 和 (79.92±0.001)℃。每組的熔解曲線在補(bǔ)充數(shù)據(jù)（S4 文件）中提供。

表 1. 本研究中用于 RT-PCR 分析的引物序列。

2.8 計(jì)算流體動(dòng)力學(xué) (CFD)

為了量化施加在生物反應(yīng)器樣品上的流體誘導(dǎo)應(yīng)力，我們進(jìn)行了 CFD 模擬。對于單獨(dú)的彎曲流動(dòng)和循環(huán)彎曲的情況，我們結(jié)合了移動(dòng)邊界分析；我們之前的工作詳細(xì)描述了 CFD 方法的細(xì)節(jié)。模擬了單獨(dú)流動(dòng)、單獨(dú)循環(huán)彎曲、流動(dòng)和彎曲組合以及無流動(dòng)四種情況。對于單獨(dú)的彎曲流動(dòng)和穩(wěn)定流動(dòng)的情況，我們使用了 0.1067 m/s 的入口速度邊界條件，這代表了實(shí)驗(yàn)規(guī)定的 850 ml/min 的流速。生物反應(yīng)器壁沒有規(guī)定滑移條件，而對于單獨(dú)的彎曲流動(dòng)和循環(huán)彎曲，樣品壁的速度設(shè)置為等于網(wǎng)格速度。生物反應(yīng)器的出口設(shè)置為零相對壓力邊界條件。所有模擬均采用牛頓粘性模型，采用層流條件，流體材料特性如下：密度 = 1.01g/cm3，動(dòng)態(tài)粘度 = 1.27 cp。在滿足每個(gè)動(dòng)量、連續(xù)性和網(wǎng)格位移方程的 1x10^(-9) 收斂標(biāo)準(zhǔn)后，對結(jié)果進(jìn)行分析。所有模擬均在 Hewlett Packard 工作站上進(jìn)行，工作站配備英特爾 (R) Xeon(R) CPU、x5550@ 2.67GHz（2 個(gè)處理器），安裝內(nèi)存為 16.0 GB，操作系統(tǒng)為 64 位 Windows 7。

為了表示剪切應(yīng)力大小和流動(dòng)中時(shí)間振蕩的耦合效應(yīng)，我們使用了振蕩剪切指數(shù) (OSI) 縮放的剪切應(yīng)力大小，我們之前將其定義為：

其中 TSSM 是時(shí)間平均剪切應(yīng)力大小。OSI 本身定義為：

其中，“τ”是流體引起的剪切應(yīng)力，“T”是周期，“t”是時(shí)間。OSI 范圍從 0 到 0.5；OSI 為 0 表示單向流動(dòng)，而 OSI 為 0.5 表示流動(dòng)中存在高度的時(shí)間振蕩（S5 文件）。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

進(jìn)行單因素方差分析，以檢驗(yàn)四組膠原蛋白生成、圖像分析和基因表達(dá)結(jié)果之間的顯著差異（n = 3 個(gè)樣本/組/結(jié)果）。隨后進(jìn)行 Tukey 事后檢驗(yàn)，以確定各組之間的顯著差異。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用社會科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包 (SPSS) 軟件進(jìn)行。觀察到各組之間的顯著差異發(fā)生在顯著性水平 p < 0.05。

三、結(jié)果

3.1 膠原蛋白含量

生理相關(guān)的柔性流動(dòng)機(jī)械調(diào)節(jié)進(jìn)一步增強(qiáng)了工程 ECM 中的膠原蛋白：膠原蛋白是心臟瓣膜組織中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白，在周期性彎曲、周期性拉伸和脈動(dòng)流機(jī)械狀態(tài)下不斷重塑。針對心臟瓣膜的組織工程，我們研究了生理相關(guān)尺度下的彎曲和/或穩(wěn)定流動(dòng)模式的機(jī)械刺激如何促進(jìn) BMSCs 衍生的新生組織中的膠原蛋白含量。

靜態(tài)組的平均膠原蛋白產(chǎn)量為 40.91±4.23（無流動(dòng)、無彎曲）、93.29±12.6（僅流動(dòng)）、69.75±2.68（僅周期性彎曲）、207.38±36.61（柔性流動(dòng)）μg/g 濕重（圖 2）。與其他三組相比，flex-flow 組的膠原蛋白含量明顯較高 (p<0.05)。靜態(tài)組、僅流動(dòng)組和僅 flex 組之間沒有顯著差異。這一觀察結(jié)果與先前的研究結(jié)果一致。為了進(jìn)行比較，評估了豬主動(dòng)脈瓣葉的膠原蛋白含量 (n = 3 個(gè)瓣葉)，結(jié)果為 2141.17±491.56 μg/g 濕重 (S2 文件)。

圖 2. 所研究各組樣本中的膠原蛋白含量。與所有其他組相比，F(xiàn)lex-Flow 組產(chǎn)生的膠原蛋白明顯較高 (p < 0.05)。

3.2 組織學(xué)

BMSC 植入支架的 Flex-Flow 調(diào)節(jié)可增加 ECM 中膠原蛋白和 GAG 的存在：暴露于瓣膜相關(guān)機(jī)械刺激的 BMSC 衍生工程組織經(jīng)過組織學(xué)處理，以可視化瓣膜基質(zhì)的三個(gè)關(guān)鍵 ECM 成分：膠原蛋白、GAG 和彈性蛋白。

經(jīng)過 8 天的靜態(tài)培養(yǎng)后，在生物反應(yīng)器中接受 Flex-Flow 機(jī)械調(diào)節(jié) 14 天的樣本顯示出工程組織 ECM 中存在膠原蛋白和 GAG 的證據(jù)（圖 3）。然而，彈性蛋白的存在尚不確定，很可能不存在，這通常是體外生長的瓣膜組織的情況。

圖 3. Russell 的 Movat 五色組織學(xué)染色：a) 培養(yǎng) 22 天后 BMSC 接種支架的全厚度切片（8 天靜態(tài) + 14 天 Flex-Flow 調(diào)節(jié)，b) 天然豬主動(dòng)脈瓣葉的全厚度切片（+ve 對照）。顏色代碼藍(lán)色：糖胺聚糖 (GAG)，黃綠色：膠原蛋白，黑色：彈性蛋白，紅色：肌肉，天然瓣膜 ECM 的三個(gè)主要成分中，膠原蛋白和 GAG 在組織工程結(jié)構(gòu)中清晰可見；然而，彈性蛋白的存在尚不確定，可能不存在。

3.3 免疫熒光染色

Flex-Flow 條件促進(jìn) BMSC 分化的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在工程組織中的瓣膜樣分布：為了評估分化的 BMSC 在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)后如何在新生 ECM 中分布，對從表面到結(jié)構(gòu)內(nèi)更深層的工程組織連續(xù)切片進(jìn)行了免疫染色。

僅在 flex-flow 組中，與瓣膜小葉表面相比，α-SMA 在中間核心層中顯著（p < 0.05）（圖 4a 和 4b）。此外，與標(biāo)本的中間核心區(qū)域相比，僅在 flex-flow 組中，表面層（頂部和底部）中內(nèi)皮標(biāo)志蛋白 CD31 豐富（p < 0.05）（圖 5）。所有其他組均未產(chǎn)生 CD31 和 α-SMA 的表達(dá)（靜態(tài)、僅彎曲組）或隨機(jī)分布（僅流動(dòng)）（S2 文件）。

圖 4. a) 瓣膜兩個(gè)表面層（每側(cè)厚度約 90μm）、中間核心（間質(zhì)組織）區(qū)域（厚度約 400 μm）上的 α-SMA 蛋白的免疫熒光染色；第一行：靜態(tài)對照；第二行：Flex；第三行：Flow；第四行：Flex-Flow 條件作用；第五行：豬心臟瓣膜作為陽性對照。在實(shí)驗(yàn)組中，僅在 Flex-Flow 組中，發(fā)現(xiàn) α-SMA 表達(dá)細(xì)胞在工程組織間質(zhì)區(qū)域（中間層）內(nèi)占主導(dǎo)地位；b) 量化四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中 α-SMA 信號強(qiáng)度的陽性染色（綠色；來自部分 a 中的圖像）；與對照組相比，暴露于 flex-flow 的樣品表達(dá)的陽性 α-SMA 水平明顯更高（p < 0.05）。將 PHV 視為陽性對照。

圖 5. EC 標(biāo)記 CD31 在瓣膜組織的兩個(gè)表面層（每側(cè)厚度約 90μm）、中間核心部分（厚度約 400 μm）上的免疫熒光染色；第一行：靜態(tài)對照；第二行：Flex；第三行：Flow；第 4 行：Flex-Flow 條件；第 5 行：豬心臟瓣膜作為陽性對照。在實(shí)驗(yàn)組中，僅在 flex flow 組中，CD31 表達(dá)細(xì)胞在工程組織的淺層（頂層和底層）內(nèi)可見。b) 四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中 CD31 信號強(qiáng)度的陽性染色（綠色；來自部分 a 中的圖像）的量化；與對照組相比，暴露于 flex-flow 的樣本表達(dá)的陽性 CD31 水平明顯更高（p < 0.05）。PHV 被視為陽性對照。

3.4 基因表達(dá)

Flex-Flow 條件表明支持瓣膜表型的早期證據(jù)：對選定標(biāo)記物的初步基因表達(dá)進(jìn)行了評估，以確定組合的 FlexFlow 條件是否增強(qiáng)了體外生長結(jié)構(gòu)中的心臟瓣膜表型。

在從 flex-flow 組中提取的 RNA 中觀察到 FZD2 和 YARS 標(biāo)記物（心血管 SMC（當(dāng) MLC1f 未表達(dá)時(shí)）和 EC 相關(guān)基因）的最高表達(dá)水平，其中樣品暴露于生物反應(yīng)器中的組合循環(huán)彎曲（1 Hz）和流動(dòng)（850 ml/min）條件（圖 6）；請注意，MLC1f 僅在無流量對照組中顯著表達(dá)（P < 0.05）。與研究的其他組（無流量控制、僅流量、僅周期性彎曲）相比，在彎曲流動(dòng)情況下，對瓣膜發(fā)育中的瓣膜形成至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子 KLF2A 也顯著表達(dá)（p<0.05）（S2 文件）。

圖 6. BMSC 衍生的工程瓣膜組織的基因表達(dá)。研究的四個(gè)組為：靜態(tài)對照、Flow（850 ml/min）、Flex（1 Hz）和 Flex-Flow（同時(shí)應(yīng)用 850 ml/min 流速和 1Hz 頻率對標(biāo)本進(jìn)行循環(huán)彎曲）。細(xì)胞培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器調(diào)節(jié)室中循環(huán)的流速為 850ml/min，允許在內(nèi)壁和外壁上分別產(chǎn)生 2.91 達(dá)因/cm2 和 4.73 達(dá)因/cm2 的生理相關(guān) 4 流體誘導(dǎo)平均剪切應(yīng)力。PHV 被視為陽性對照，作為參考。

3.5 計(jì)算結(jié)果

Flex-Flow 培養(yǎng)標(biāo)本的剪切應(yīng)力大小和振蕩屬于心臟瓣膜的生理范圍和剪切應(yīng)力分布：量化組織工程標(biāo)本上流體誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力空間和時(shí)間分布需要進(jìn)行 CFD 模擬，然后對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

在所有模擬情況下，在內(nèi)表面和外表面上繪制了流體誘導(dǎo)的時(shí)間平均剪切應(yīng)力大小 (TSSM)（圖 7）。靜態(tài)控制、單獨(dú)穩(wěn)定流、單獨(dú)循環(huán)彎曲和彎曲流動(dòng)情況下的內(nèi)壁 TSSM 值分別為 0 達(dá)因/厘米2、1.98 ± 0.37 達(dá)因/厘米2、0.1 ± 0.005 達(dá)因/厘米2 和 2.91 ± 0.11 達(dá)因/厘米2?？刂啤为?dú)穩(wěn)定流、單獨(dú)循環(huán)彎曲和彎曲流動(dòng)情況下的外壁 TSSM 值分別為 0 達(dá)因/厘米2、2.43 ± 0.06 達(dá)因/厘米2、0.1 ± 0.003 達(dá)因/厘米2 和 4.73 ± 0.09 達(dá)因/厘米2。

圖 7. 以下四種情況下，在試樣內(nèi)壁和外壁上，一個(gè)周期內(nèi)流體誘導(dǎo)的時(shí)間平均剪切應(yīng)力：i) 靜態(tài)控制、ii) 流動(dòng)、iii) 彎曲和 iv) 柔性流動(dòng)狀態(tài)。在比較兩種動(dòng)態(tài)情況 (iii) 與 (iv) 時(shí)，柔性流動(dòng)狀態(tài)顯示出更高的剪切應(yīng)力值。

而外壁（n = 3）的相應(yīng)值分別為 0.313± 0.011 和 0.094± 0.10。確定面積平均 OSI指標(biāo)以量化實(shí)驗(yàn)中耦合剪切應(yīng)力大小和時(shí)間振蕩的程度。在樣本區(qū)域（樣本大小 n = 3/組），內(nèi)壁的面積平均 OSI為 0.1±0.05 達(dá)因/厘米2（單獨(dú)循環(huán)彎曲）和 0.41±0.11 達(dá)因/厘米2（彎曲流動(dòng)），而外壁的面積平均 OSI為 0.16 ±0.03 達(dá)因/厘米2（單獨(dú)循環(huán)彎曲）和 0.27±0.16 達(dá)因/厘米2（彎曲流動(dòng)）（圖 8）。請注意，如果流動(dòng)在時(shí)間上是單向的，或者流體引起的剪切應(yīng)力可以忽略不計(jì)，則 OSI- 2 = 0，這分別是單獨(dú)穩(wěn)定流動(dòng)和無流動(dòng)的情況。

圖 8. 動(dòng)態(tài)柔性和柔性流動(dòng)情況下，樣本內(nèi)外表面的 OSI 縮放剪切應(yīng)力大小。

四、討論

功能性心臟瓣膜置換，特別是兒科危重瓣膜疾病，迫切需要合適的治療方法；主要限制是，目前可用的置換裝置無法提供軀體生長。因此，自體和活體生物心臟瓣膜替代品的概念非常有吸引力。多項(xiàng)研究表明，開發(fā)堅(jiān)固的工程瓣膜組織的過程需要一個(gè)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)過程，其中機(jī)械應(yīng)力（例如流動(dòng)、彎曲和拉伸）會施加到生長的結(jié)構(gòu)上。這些應(yīng)力狀態(tài)尤其重要，因?yàn)榘昴ば∪~在心動(dòng)周期中經(jīng)歷高度變化且依賴于小葉側(cè)的流體誘導(dǎo)剪切應(yīng)力分布，以及局部周期性組織拉伸和彎曲。例如，在主動(dòng)脈瓣中，與動(dòng)脈側(cè)相比，小葉的心室側(cè)經(jīng)歷的流體誘導(dǎo)剪切應(yīng)力明顯更高。一些體外研究已經(jīng)能夠重現(xiàn)這種血液動(dòng)力學(xué)環(huán)境的重要特征，使用生物反應(yīng)器從頭生長瓣膜組織。然而，體外機(jī)械調(diào)節(jié)對結(jié)構(gòu)內(nèi)細(xì)胞分布和表型的具體影響仍不清楚。這些屬性可以支持工程化組織與天然組織的整合，從而可以在指導(dǎo)體內(nèi)后續(xù)瓣膜重塑事件中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，維持生理范圍的調(diào)節(jié)參數(shù)（例如流體誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力）的重要性也未得到充分解決。另一方面，迄今為止，干細(xì)胞（如 BMSCs）的效用已在幾種心臟瓣膜組織工程方法中得到探索，這些方法已證明在機(jī)械刺激環(huán)境下組織生長強(qiáng)勁。因此，為了確定瓣膜相關(guān)應(yīng)力環(huán)境對干細(xì)胞表型的影響，以及機(jī)械調(diào)節(jié)的生理尺度的影響，我們將 BMSC 植入支架置于流體剪切和彎曲應(yīng)力狀態(tài)的單獨(dú)和組合模式中，這兩種狀態(tài)都與瓣膜組織高度相關(guān)。

我們發(fā)現(xiàn) flexflow 組的 BMSC 衍生膠原蛋白含量相對于其他組顯著增加 (p<0.05)，而靜態(tài)控制、Flex 和 Flow 組之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異 (圖 2)。我們的觀察結(jié)果與先前的發(fā)現(xiàn)一致，其中亞生理剪切應(yīng)力下的 flex-flow 研究 (平均壁面剪切應(yīng)力 = 1.15 達(dá)因/厘米2) 與生理水平的周期性彎曲 (1Hz，相當(dāng)于心率為 60 次/分鐘) 相結(jié)合。然而，我們試圖在我們工程組織標(biāo)本上重現(xiàn)天然主動(dòng)脈瓣液誘導(dǎo)剪切應(yīng)力分布的區(qū)域變化和側(cè)面特異性。事實(shí)上，先前的工作已經(jīng)證明，我們標(biāo)本的內(nèi)壁和外壁類似于瓣葉的主動(dòng)脈側(cè)和心室側(cè)。在這里，在彎曲流動(dòng)狀態(tài)下，外壁上的 TSSM 為 4.73 達(dá)因/厘米2，而沿內(nèi)壁，剪切應(yīng)力為 2.91 達(dá)因/厘米2。天然人類主動(dòng)脈瓣的心室側(cè)暴露于約 3.87 達(dá)因/厘米2 的 TSSM，因此，本研究中確定的彎曲流動(dòng)標(biāo)本的剪切應(yīng)力具有生理相關(guān)性。將我們的研究與在亞生理剪切應(yīng)力水平下進(jìn)行的研究進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)膠原蛋白的產(chǎn)生額外增加了 70%，即當(dāng)標(biāo)本的剪切應(yīng)力大小和分布在區(qū)域上與天然主動(dòng)脈瓣葉相似時(shí)。我們注意到，早期的一項(xiàng)研究通過體外模擬動(dòng)脈壓力條件證明了生理調(diào)節(jié)尺度的重要性，最終導(dǎo)致膠原蛋白含量與亞生理流動(dòng)環(huán)境相比增加了約 35%。我們推測，在我們的案例中，差異更為明顯，這是由于細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制直接導(dǎo)致的，已知這些機(jī)制是由流體誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力啟動(dòng)的，我們認(rèn)為這些機(jī)制也適用于分化 BMSC。

先前的研究已經(jīng)檢查了 TEHV 中細(xì)胞的全厚度分布和表型。與采用亞生理范圍剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)的柔性流動(dòng)研究一致，我們觀察到內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)主要在表面表達(dá)，在間質(zhì)層中可忽略不計(jì)（圖 4）。我們認(rèn)為，在流動(dòng)狀態(tài)下，BMSC 向內(nèi)皮細(xì)胞的分化和支架內(nèi) BMSC 遷移模式得到增強(qiáng)，并且與流量大小沒有很強(qiáng)的依賴性。事實(shí)上，我們之前通過磁共振成像可視化并監(jiān)測了細(xì)胞支架遷移模式的增加，發(fā)現(xiàn)與無流量控制相比，在穩(wěn)定流動(dòng)條件下，這種增加得到增強(qiáng)。另一方面，機(jī)械環(huán)境與新生瓣膜組織內(nèi) α-SMA 表達(dá)細(xì)胞之間的聯(lián)系并不那么簡單。研究人員證明，在受到產(chǎn)生亞生理量級的流體誘導(dǎo)剪切應(yīng)力的彎曲流動(dòng)狀態(tài)后，表達(dá) α-SMA 的 BMSC 會優(yōu)先分布在工程心臟瓣膜組織的表面，并表現(xiàn)出強(qiáng)勁表達(dá)。同時(shí)，Hoestrup 及其同事描述了在生物反應(yīng)器中受到生理壓力范圍（30 至 75 mmHg）的三葉工程瓣膜結(jié)構(gòu)中表達(dá) α-SMA 的 BMSC 的一致分布；此外，細(xì)胞密度在 TEHV 表面最大，而在組織深處則稀疏。我們觀察到，應(yīng)用心臟瓣膜生理相關(guān)的流體誘導(dǎo)剪切應(yīng)力（TSSM，內(nèi)壁：2.91dyne/cm2 和外壁：4.73dyne/cm2）有助于促進(jìn)細(xì)胞形成，尤其是表達(dá) αSMA 的 BMSC（圖 4）。雖然這種情況在單獨(dú)流動(dòng)和彎曲流動(dòng)條件下都會發(fā)生，但只有在后者中，α-SMA 表達(dá)細(xì)胞在工程組織的間質(zhì)區(qū)域內(nèi)占主導(dǎo)地位，而在表層上則稀疏。另一方面，如前所述，僅在彎曲流動(dòng)組中，具有內(nèi)皮表型的 CD31 表達(dá)細(xì)胞優(yōu)先分布在工程組織標(biāo)本的表面上（圖 5）。盡管 α-SMA 和 CD31 免疫熒光染色的程度不如天然瓣膜明顯，正如基因表達(dá)結(jié)果中瓣膜相關(guān)標(biāo)記物所證明的那樣，很明顯，彎曲流動(dòng)調(diào)節(jié)的生理尺度以模仿天然瓣膜細(xì)胞分布的方式促進(jìn)異質(zhì)細(xì)胞分布。我們認(rèn)為，在體外環(huán)境中實(shí)現(xiàn)異質(zhì)性、瓣膜相關(guān)的 BMSC 分布和分化的能力在植入后持續(xù)組織重塑中起著關(guān)鍵作用，包括加速復(fù)制原生三層瓣膜結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)僅在 TEHV 植入后數(shù)周（16-32 周）的綿羊研究中觀察到，并且僅限于更換肺動(dòng)脈瓣，而不是更換要求更高的主動(dòng)脈瓣或二尖瓣位置。因此，在心臟瓣膜疾病的特定情況下，例如在治療嬰兒嚴(yán)重的先天性主動(dòng)脈瓣狹窄時(shí)，加速組織重塑可能特別重要，以跟上軀體生長的步伐。

作為瓣膜形成的進(jìn)一步證據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)與所有其他組相比，柔性流調(diào)節(jié)顯著增強(qiáng)了（p < 0.05）KLF2A 基因（圖 6）。在天然瓣膜發(fā)育過程中，KLF2A 的缺失會導(dǎo)致嚴(yán)重的瓣膜畸形，并直接受到振蕩流體誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力的調(diào)節(jié)。有趣的是，我們能夠證明，在柔性流動(dòng)條件下，干細(xì)胞（而不是內(nèi)源性瓣膜細(xì)胞，特別是 BMSC）也可能上調(diào) KLF2A 的表達(dá)。我們之前的研究表明，OSS 在柔性流動(dòng)條件下得到增強(qiáng)，因此很可能引發(fā)細(xì)胞 KLF2A 的上調(diào)。

當(dāng)對 flexflow 組中觀察到的 KLF2A 標(biāo)記物表達(dá)與相應(yīng)的天然瓣膜基因表達(dá)進(jìn)行集體比較時(shí)，我們毫不意外地發(fā)現(xiàn)，天然瓣膜表達(dá)更高，約為 49%。與從天然瓣膜組織中獲得的細(xì)胞的基因表達(dá)相比，在時(shí)間有限的體外培養(yǎng)環(huán)境中，BMSCs 的密度明顯較低，很可能表現(xiàn)出截?cái)嗟幕虮磉_(dá)水平。然而，需要考慮的更廣泛的論點(diǎn)是，體外瓣膜表型的促進(jìn)，即使很小，也可能對增強(qiáng)植入后工程化與天然瓣膜組織之間的整合至關(guān)重要。從表型的角度來看，周圍體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境對工程化結(jié)構(gòu)的識別可能對旁分泌細(xì)胞信號傳導(dǎo)事件至關(guān)重要，這將有助于確保 TEHV 的引導(dǎo)重塑，并最大限度地降低組織過度生長和不受控制的血管翳的風(fēng)險(xiǎn)。先前的研究已經(jīng)證明了在 TEHV 中重現(xiàn)原生三層組織結(jié)構(gòu)對于支持強(qiáng)大功能的重要性。同樣，我們推測 BMSC 衍生的工程化構(gòu)造的表型狀態(tài)在植入前同樣重要，我們在此表明其針對的是柔性流動(dòng)機(jī)械調(diào)節(jié)下的瓣膜譜系。因此，我們解釋為在體外培養(yǎng)工程組織期間的柔性流動(dòng)機(jī)械調(diào)節(jié)以異質(zhì)方式支持 BMSC 分化，即通過促進(jìn)瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞表型。這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)了我們之前的計(jì)算預(yù)測，即在柔性流動(dòng)狀態(tài)下同時(shí)存在 OSS 和臨界剪切應(yīng)力會協(xié)同增加工程組織中的膠原蛋白含量，這似乎也增強(qiáng)了瓣膜表型，正如這里所證明的那樣。

總之，生理相關(guān)的彎曲流動(dòng)狀態(tài)有助于促進(jìn)體外生長的 BMSC 衍生的工程心臟瓣膜組織中的細(xì)胞分布和表型。我們首次能夠證明 BMSC 在工程組織內(nèi)的分化和遷移導(dǎo)致表面襯里的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)細(xì)胞和間質(zhì)填充的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)細(xì)胞，從而類似于天然瓣膜細(xì)胞分布。此外，OSS 與臨界水平的剪切應(yīng)力的共存使得關(guān)鍵瓣膜基因（特別是 KLF2A）的非常早期階段能夠強(qiáng)勁表達(dá)。請注意，單獨(dú)的彎曲狀態(tài)會誘導(dǎo) OSS，但具有可忽略不計(jì)的剪切應(yīng)力大小，并且被發(fā)現(xiàn)不會增加工程組織內(nèi)的細(xì)胞和表型；這與我們之前的發(fā)現(xiàn)一致，無論是時(shí)間方向性還是剪切應(yīng)力的大小，在引發(fā) BMSC 反應(yīng)方面都很重要，我們在此展示了這可以在彎曲流動(dòng)狀態(tài)下通過實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。我們得出結(jié)論，通過生理相關(guān)的彎曲流動(dòng)條件可以實(shí)現(xiàn) BMSC 衍生的工程化心臟瓣膜細(xì)胞組成和表型的體外優(yōu)化。刺激異質(zhì)瓣膜細(xì)胞和表型的能力可能在指導(dǎo)瓣膜細(xì)胞分布的早期階段以及隨后的體內(nèi)瓣膜組織重塑事件方面很重要，以確保兒科患者 TEHV 的長期成功。

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